单分子纳流动力学与DNA序列测定

     

图1：纳米孔应用

      众所周知，DNA是生物体遗传信息的载体。2003年，人类基因组计划第一次完成了人类基因组完整序列的测定。利用基因技术直接造福每个个人的梦想正逐渐成为可能。而发展快速而廉价的DNA测序技术，是将基因技术应用到个人服务的关键。目前，利用第二代测序仪测定单个个人基因序列的费用约10万美元。第三代测序技术的目标是在24小时内以低于1000美元的费用实现单个个人基因组完整序列的测定。

     在众多的第三代测序仪核心技术构想中，纳米孔（nanopore）技术因其独特的优势而被人们广泛关注。纳米孔是指纳米薄膜上直径5-10纳米的介孔—与DNA分子的直径相当。在电解溶液中通过电泳驱动DNA分子穿过纳米孔时，DNA分子的结构信息与探测的电学或光学信号存在对应关系，由此可以直接对含数千碱基的单个DNA分子进行表征、测序。这一技术避免了传统测序技术中扩增和标记等复杂环节，使得快速、低成本的DNA测序技术成为可能。目前，基于固体纳米孔的DNA实时测序技术已是研究的热点。2009年10月，IBM公司宣布加入基于固态纳米孔器件的下一代人类基因组测序计划，标志着固态纳米孔器件的研究开始走向应用。纳米孔器件测序技术可以分为生物纳米孔和固态纳米孔两种。2014年，牛津纳米孔技术公司发布了便携式且仅有手机大小的生物纳米孔测序仪——MinION，标志着基于生物纳米孔的测序技术已经成功商业化。

图2：DNA穿越纳米孔

      对比生物纳米孔，固态纳米孔的主要优势包括：可以精确调节孔的大小、沟道深度；表面特性可控；对环境较高的稳定性、使用寿命长；可以进行器件集成和大规模阵列应用等等。其制备主要是利用近年来兴起的微加工手段，如在透射电镜中利用高能聚焦电子束直接进行精确的制备，对直径和形状的控制可优于1纳米的精度。尽管生物纳米孔测序技术发展要早于固态纳米孔测序技术，但从长远的角度来看，固态纳米孔测序技术有着广阔的发展前景及更为灵活多变的应用价值。度。

      本研究组正在开展基于纳米孔的DNA单分子纳流动力学及序列测定研究。研究主要集中在如下几个方面：1）高效的超薄固态纳米孔制备技术；2）单个DNA分子在纳米孔中运动的控制；3）基于单个碱基的信号辨别; 4）生物大分子动态修饰的研究。

图3：四面体折纸修饰的探测。（Nanoscale, 11, 6263-6269 (2019)）

      目前已实现了氮化硅薄膜和石墨烯悬空膜上纳米孔的制备，最小孔径可达５纳米。通过测量离子电流，我们可以监测单个DNA分子穿过纳米孔的过程，并能对运动方向进行控制。通过对运动控制电路的进一步改进，将能实现对DNA分子在纳米孔中运动的精准控制，并有望获得单个DNA分子内部结构的测定。利用固态纳米孔探测了四面体折纸修饰的DNA分子穿孔运动，得到了穿孔事件的时间和空间分辨。正在利用牛津纳米的生物纳米孔测序仪MinION进行单链DNA分子修饰的探索。

 

图4：直径7纳米的SiN纳米孔，及其单个DNA穿孔的离子电流信号。

      通过离子电流信号，我们还将可以对单个DNA分子进行各种物理性质的研究，包括：DNA的解聚合动力学；单碱基多态性探测；双链DNA分子的拉伸转变；生物分子折叠；基于长度的DNA分子识别；基于纳米孔的DNA分子力谱分析，DNA单分子微/纳流动力学等。这种基于纳米孔的单分子测控技术亦适用于许多其他链状生物分子的精确运动控制。可以预期，这一技术的发展将推动与此相关的生物和医学等学科的发展。

图5：使用的部分仪器